細(xì)胞免疫熒光檢測（IF)操作步驟

    免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結(jié)合，其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識別并結(jié)合一抗，熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下即可觀察到熒光。實驗步驟如下：

1. 接種細(xì)胞:將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于共聚焦專用培養(yǎng)皿里，培養(yǎng)24小時。

2. 固定：待細(xì)胞融合度達(dá)到50-70%時，棄去培養(yǎng)基，用冰冷PBS洗3遍，然后加入4%冷的多聚甲醛固定20分鐘。

3. 清洗：棄去多聚甲醛后，用冰冷PBS洗三遍，每次5分鐘。

4. 破膜：加入0.25%Triton X-100（PBS配制）破膜20分鐘。

5. 清洗：冰冷PBS洗三遍，每次5分鐘。

6. 封閉：加入含5%BSA的PBS室溫封閉1小時。

7. 一抗孵育：加入含5%BSA的PBS配制的一抗溶液室溫孵育2小時或4℃過夜。

8. 清洗：加入PBST（含0.1%吐溫20）洗三遍，每次5分鐘。

9. 二抗孵育：加入含5%BSA的PBS配制的二抗溶液室溫孵育1小時（避光）。

10.清洗：加入PBST洗三遍，每次5分鐘。

11.DAPI染核：加入DAPI染色液，室溫染色10分鐘。

12.加入PBST洗三遍，每次5分鐘。

13.上機(jī)檢測。